Claudin-5 Proteins of the Blood-Brain Barrier: Molecular Modeling and Simulations From Structures to Therapeutic Strategies

The blood-brain barrier (BBB) is a multicellular structure comprising pericytes, astrocytes, and endothelial cells that protects the brain parenchyma and maintains its homeostasis. Endothelial cells form the walls of brain capillary vessels and serve as a primary defense layer against the uncontrolled passive diffusion of solutes from the bloodstream. While the selective transcellular passage of molecules is mediated by the presence of specific transmembrane transporters, the permeation through the narrow region separating adjacent cells, named the paracellular space, is strictly limited by heterogeneous protein complexes named tight junctions (TJs). The major components of TJs in the BBB are claudin-5 (Cldn5) proteins, that arrange into multimeric assemblies to form strands running along the lateral membranes of adjoining cells, where they prevent the translocation of almost each solute across the paracellular route. Despite the well-established physiological relevance of Cldn5 proteins, the precise structural arrangement of these systems within the TJ strands remains elusive, primarily due to the poor availability of experimental structures. To date, two main structural models, denoted as Pore I and Pore II, have been introduced in the literature as building blocks of Cldn paracellular multimeric complexes for various proteins belonging to this family. Interestingly, both these arrangements are based on a tetrameric organization, wherein two pairs of molecules belonging to the respective cell membrane interact at the paracellular level shaping a porous scaffold. Although several studies, mostly computational, contributed to refine and characterize these two models, a comprehensive comparison of their features is still lacking, along with the assessment of their transferability among different Cldn homologs. Beyond the structural validation, shedding light on the molecular determinants of the topological and functional properties of Cldn5 assemblies has paramount implications in clinical settings as well. Indeed, in because of the critical role of the BBB as a guarantor of the chemical environment of the Central Nervous System (CNS), its presence poses a formidable obstacle in case of brain impairments, hindering the direct delivery of drugs. A promising approach to handle this challenge consists in using competitive peptides that target Cldn5 proteins, thus interfering with the formation of TJs and generating temporary fenestrations across the paracellular spaces that could allow the pharmaceuticals to cross the brain endothelium. In this thesis, both the structural validation and the practical application aspects have been addressed by leveraging the powerful capabilities of molecular modeling and simulation methods to investigate biological systems at atomic resolution. Firstly, Pore I and Pore II have been assembled with Cldn5 monomers in both the wild type and various mutated variants and investigated through all-atom molecular dynamics (MD) simulations on the microsecond timescale, to assess the structural properties of the two arrangements. Moreover, biased MD simulations with the umbrella sampling method were performed to compute the free energy profiles of ion permeation across the pore cavities. Results from this analysis suggested that both the pore configurations are compatible with the physiological function of Cldn5 in the BBB, but only Pore I free energy profiles were consistent with the 7 experimental outcomes shown for the pathogenic variant of the protein. To assess the transferability of the two architectures to another Cldn homolog, we chose the anion selective Cldn4, and the free energy calculations revealed again Pore I as the functionally consistent one. Then, in the second part of the dissertation, it is presented a computational workflow to design and characterize peptides of a limited size (up to 16 residues), featuring appropriate solubility and Cldn5 binding properties. The use of relatively short sequences has many advantages, including the ease of synthesis, higher metabolic stability, improved biocompatibility, and limited cost. Moreover, it allows more accurate computational modeling as well. The procedure illustrated in this section is based on a well-rounded application of molecular modeling methods, including homology modeling, molecular docking simulations, and standard and biased MD simulations, that allowed the identification of a peptide, referred to as f1-C5C2, exhibiting a pronounced affinity for Cldn5 proteins. Remarkably, these findings were confirmed by experimental characterization of the peptide carried out by collaborators at the Center for Synaptic Neuroscience and Technology (NSYN) of the Fondazione Istituto Italiano di Tecnologia (IIT) in Genoa, Italy, underscoring the successful integration of the in silico and in vitro approaches at the basis of this investigation. Taken together, the results presented in this thesis aim to advance the understanding of the molecular features of Cldn assemblies within TJ strands, offering valuable insights to drive the rational design of effective peptides with potential beneficial impact from a clinical perspective.

La barriera emato-encefalica (blood-brain barrier, BBB) è una struttura multicellulare, comprendente periciti, astrociti e cellule endoteliali, che riveste l’ambiente neuronale per mantenere l’omeostasi del Sistema Nervoso Centrale (Central Nervous System, CNS). Le cellule endoteliali formano le pareti dei capillari che si interfacciano con i tessuti neurali e fungono da linea di difesa primaria contro la diffusione passiva incontrollata di soluti dal flusso sanguigno al cervello. Mentre il passaggio di molecole per la via transcellulare è mediato dalla presenza di specifici trasportatori proteici transmembrana, la permeazione attraverso la ristretta regione che separa cellule adiacenti, chiamato lo spazio paracellulare, è limitata da eterogenei complessi di proteine chiamati Giunzioni Strette (Tight Junctions, TJs). I componenti maggioritari delle TJs nella BBB sono le proteine di claudina-5 (Cldn5), che si organizzano in sistemi multimerici per formare filamenti adesi alle membrane basolaterali di cellule contigue, dove prevengono la traslocazione di quasi ogni soluto attraverso la via paracellulare. Nonostante la loro nota rilevanza fisiologica, la precisa disposizione strutturale delle proteine di Cldn5 nei filamenti di TJs è tuttora poco chiara, principalmente a causa mancanza di strutture sperimentali tridimensionali. Ad oggi, due modelli strutturali, denotati come Poro I e Poro II, sono stati introdotti in letteratura come potenziali descrittori dei complessi multimerici di claudine per varie proteine appartenenti a questa famiglia. Entrambi questi modelli propongono una organizzazione tetramerica, nella quale due coppie di molecole appartenenti alle rispettive membrane cellulari interagiscono a livello paracellulare dando forma a una struttura porosa. Sebbene diversi lavori abbiano contribuito a raffinare questi due sistemi grazie ad una preponderante applicazione di metodi computazionali, rimane ancora carente un’esaustiva comparazione delle loro proprietà, così come una valutazione della loro trasferibilità tra diverse claudine omologhe, appartenenti ad altri tessuti. Oltre alla validazione strutturale, fare luce sugli aspetti molecolari della topologia e funzionali dei multimeri di Cldn5 ha implicazioni fondamentali anche in ambito clinico. Infatti, nonostante il ruolo centrale della BBB di garante dell’equilibrio chimico del CNS, la sua presenza rappresenta un notevole ostacolo in caso di patologie neurologiche, impedendo il passaggio di numerosi farmaci e nutrienti diretti al cervello. Un approccio promettente per affrontare questa problematica consiste nell’utilizzo di peptidi affini alla Cldn5. September 2022 – Participation to Ischia Summer Modeling 2022, in Ischia, Italy. The conference designed for theoretically oriented scientists and provided a platform to share ideas and knowledges at the cutting-edge of different fields of molecular sciences, including inter alia, astrochemistry, environmental chemistry, material, and life sciences. 5 Questi oligomeri sarebbero in grado di formare complessi con la proteina, interferendo con la formazione delle TJs, e generando fenestrazioni temporanee attraverso gli spazi paracellulari che potrebbero permettere ai farmaci di penetrare l’endotelio celebrale. In questa tesi, sia l’aspetto di validazione strutturale che di applicazione pratica sono affrontati sfruttando la capacità dei metodi di modeling molecolare di investigare le proprietà strutturali e termodinamiche dei sistemi biologici a livello atomico. In primo luogo, i modelli Poro I e Poro II sono stati assemblati con i monomeri di Cldn5 sia nella forma wild type che con diverse varianti mutate, ed esaminate tramite simulazioni di dinamica molecolare (Molecular Dynamics, MD) nel tempo scala del microsecondo per valutare le proprietà strutturali delle due configurazioni. Inoltre, simulazioni MD accelerate, realizzate con il metodo “umbrella sampling”, sono state effettuate per calcolare i profili di energia libera degli eventi di permeazione ionica attraverso i pori. I risultati di questa analisi suggeriscono che entrambe le configurazioni sono compatibili con la funzione fisiologica della Cldn5 nella BBB, ma solo Poro I è consistente con le evidenze sperimentali descritte per la variante patologica della proteina. Inoltre, in questa fase, la valutazione della trasferibilità di queste due architetture è stata estesa a un altro omologo, il sottotipo claudina-4 (Cldn4), per il quale i calcoli di energia libera hanno indicato una selettività opposta dei due sistemi al passaggio di anioni. Successivamente, nella seconda parte della trattazione, è presentato un protocollo computazionale per progettare e analizzare peptidi dalla lunghezza limitata (fino ad un massimo di 16 residui), solubili nel medium cellulare acquoso e in grado di legare efficientemente le proteine di Cldn5. L’uso di sequenze relativamente corte ha svariati vantaggi, inclusi la facilità di sintesi, una elevata stabilità metabolica, migliore biocompatibilità e un costo contenuto. In aggiunta, permette un più accurato impiego delle tecniche computazionali. La procedura illustrata in questo lavoro è basata su un’estensiva applicazione di metodi di metodi in silico, inclusi il modeling per omologia, simulazioni di docking molecolare e simulazioni MD standard e accelerate, che hanno permesso di identificare un peptide contraddistinto da una significativa affinità per la Cldn5, e indicato come f1-C5C2. Inoltre, questo risultato ha trovato conferma nella caratterizzazione sperimentale del peptide condotta dai collaboratori al Centro di Neuroscienze e Tecnologie Sinaptiche (NSYN) della Fondazione Istituto Italiano di Tecnologia (IIT) di Genova, sottolineando la riuscita integrazione degli approcci in silico e in vitro alla base di questa investigazione. Complessivamente, questa tesi offre una serie di risultati mirati a far progredire la comprensione delle proprietà molecolari dei complessi Cldn nelle TJs, proponendo analisi approfondite per guidare il design razionale di peptidi con un potenziale impatto benefico anche da una prospettiva clinica.