Targeted therapies (TT) and immune checkpoint inhibitors immunotherapy (ICB) has dramatically changed the treatment of metastatic melanoma (MM). Although targeted therapy achieved a response rate as high as 70%, most patients ultimately develop resistance and progressive disease. Immune checkpoint inhibitors, especially with anti-PD-1 monoclonal antibodies, achieve durable responses, but in less than 40% of patients. The majority of patients receiving these treatments ultimately face progressive disease due to the development of primary of secondary resistance. Since only a fraction of patients achieve a durable benefit, the identification of predictive biomarkers is an unmet need. The objectives of our present study are: i) Identification of new molecular targets through the extensive in vitro and in vivo characterization of tumor biopsies; ii) Investigation of associations between PD-1/PD-L1/PD-L2/CTLA-4 variants and tumor microenvironment immunoscore with overall survival of patients receiving TT and ICB; iii) Analysis of the immune effects of TT and ICB on NK cells and their interaction with melanoma cells. Forty-eight patients with advanced melanoma were enrolled and 33 tumor biopsies from 29 patients were analyzed. Patients received TT and/or anti-PD-1 drugs. We observed that TIM3 expression is associated with PD-1 expression, as it is exclusively expressed in CD8+/PD-1 high T cells, while both GmzB and Eomes are also expressed by CD8+/PD-1 low cells. Moreover, CD8+/PD-1 high T cells show a higher Ki67 expression, suggesting that these cells may proliferate within the tumor. CD8+/PD-1 neg/low T cells are able to produce both IFN and TNF after polyclonal stimulation, while CD8+/PD-1 high cells produce low levels of TNF, maintaining the ability to release IFN. The association between PD-1/PD-L1 variants with immune infiltrate highlighted the role of PD1.5C>T and PD-L1C>T rs2297136 SNV in CD8+ cells recruiting. In particular, genotypes harboring the allelic variant T+ modify both the rate of CD8+ PD-1 high cells and the intensity of PD-1 high expression, compared with wild type genotypes.

Le terapie a bersaglio molecolare (targeted therapies, TT) e l’immunoterapia con anticorpi immunomodulanti (immune checkpoint blockers, ICB) hanno rivoluzionato la terapia del melanoma metastatico (MM). Sebbene con utilizzo delle TT siano stati ottenuti tassi di risposta superiori al 70%, il tasso di recidiva e lo sviluppo di resistenze è ancora molto alto. Gli ICB, in particolare gli anticorpi monoclonali anti-PD-1, producono risposte durature, ma solo meno del 40% dei pazienti ottiene una risposta. La maggior parte dei pazienti trattati con questi farmaci va incontro a progressione della malattia dovuta a resistenza primaria o acquisita. Inoltre, poiché queste nuove terapie sono efficaci solo su una frazione di pazienti, vi è la necessità di identificare biomarcatori associati alla risposta. Gli obiettivi del presente studio sono: i) Identificare nuovi bersagli molecolari per la terapia del MM attraverso la caratterizzazione esaustiva in vitro e in vivo di mutazioni riscontrate nei campioni bioptici; ii) Correlare le varianti geniche di PD-1/PD-L1/PD-L2/CTLA-4 e il profilo immunologico (immunoscore) del microambiente tumorale, con la sopravvivenza (overall survival) dei pazienti sottoposti a targeted therapy (TT) e terapie immunomodulanti (ICB); iii) Analizzare gli effetti immunomodulanti esercitati dalle targeted therapies (TT) e dagli anticorpi monoclonali (ICB) sulle cellule NK e sulle interazioni NK-melanoma. Sono stati arruolati 48 pazienti con melanoma avanzato non pretrattato o resistente a precedente terapia con ICB o TT. Sono state analizzate 33 biopsie di metastasi di melanoma cutaneo appartenenti a 29 pazienti, trattati, secondo pratica clinica, con inibitori di BRAF e MEK e/o con anticorpi anti-PD-1. I risultati ottenuti indicano che l’espressione di TIM3 correla con i livelli di espressione di PD-1 in quanto è esclusivamente espresso dai T CD8+/PD-1 high, mentre sia GmzB che Eomes risultano espressi anche da cellule T CD8+/PD-1 low. Inoltre, le cellule T CD8+/PD-1 high mostrano anche una più alta espressione di Ki67 suggerendo che queste cellule sono in grado di proliferare all’interno del tumore. Inoltre, i linfociti T CD8+/PD-1 neg/low sono in grado di produrre sia IFN che TNF dopo stimolazione policlonale, mentre i linfociti T CD8+/PD-1 high producono bassi livelli di TNF, pur mantenendo la capacità di rilasciare IFN. La correlazione dell’infiltrato linfocitario con le varianti geniche di PD-1 e PD-L1 ha evidenziato un ruolo degli SNV PD1.5C>T e PD-L1C>T rs2297136 nel reclutamento, nelle biopsie cutanee, di linfociti T CD8+ esprimenti vari livelli di PD-1. In particolare, i genotipi portatori della variante allelica T+ modificano sia la percentuale di linfociti T CD8+ PD-1 high che l’intensità di espressione di PD-1 high (aumentate per il primo SNV e diminuite per il secondo rispettivamente), rispetto ai genotipi wild type.

Analisi fenotipica e funzionale dell’infiltrato linfocitario in biopsie di metastasi di melanoma, in pazienti in terapia con farmaci a bersaglio molecolare e/o inibitori dei checkpoint immunologici

SPAGNOLO, FRANCESCO
2020-05-19

Abstract

Le terapie a bersaglio molecolare (targeted therapies, TT) e l’immunoterapia con anticorpi immunomodulanti (immune checkpoint blockers, ICB) hanno rivoluzionato la terapia del melanoma metastatico (MM). Sebbene con utilizzo delle TT siano stati ottenuti tassi di risposta superiori al 70%, il tasso di recidiva e lo sviluppo di resistenze è ancora molto alto. Gli ICB, in particolare gli anticorpi monoclonali anti-PD-1, producono risposte durature, ma solo meno del 40% dei pazienti ottiene una risposta. La maggior parte dei pazienti trattati con questi farmaci va incontro a progressione della malattia dovuta a resistenza primaria o acquisita. Inoltre, poiché queste nuove terapie sono efficaci solo su una frazione di pazienti, vi è la necessità di identificare biomarcatori associati alla risposta. Gli obiettivi del presente studio sono: i) Identificare nuovi bersagli molecolari per la terapia del MM attraverso la caratterizzazione esaustiva in vitro e in vivo di mutazioni riscontrate nei campioni bioptici; ii) Correlare le varianti geniche di PD-1/PD-L1/PD-L2/CTLA-4 e il profilo immunologico (immunoscore) del microambiente tumorale, con la sopravvivenza (overall survival) dei pazienti sottoposti a targeted therapy (TT) e terapie immunomodulanti (ICB); iii) Analizzare gli effetti immunomodulanti esercitati dalle targeted therapies (TT) e dagli anticorpi monoclonali (ICB) sulle cellule NK e sulle interazioni NK-melanoma. Sono stati arruolati 48 pazienti con melanoma avanzato non pretrattato o resistente a precedente terapia con ICB o TT. Sono state analizzate 33 biopsie di metastasi di melanoma cutaneo appartenenti a 29 pazienti, trattati, secondo pratica clinica, con inibitori di BRAF e MEK e/o con anticorpi anti-PD-1. I risultati ottenuti indicano che l’espressione di TIM3 correla con i livelli di espressione di PD-1 in quanto è esclusivamente espresso dai T CD8+/PD-1 high, mentre sia GmzB che Eomes risultano espressi anche da cellule T CD8+/PD-1 low. Inoltre, le cellule T CD8+/PD-1 high mostrano anche una più alta espressione di Ki67 suggerendo che queste cellule sono in grado di proliferare all’interno del tumore. Inoltre, i linfociti T CD8+/PD-1 neg/low sono in grado di produrre sia IFN che TNF dopo stimolazione policlonale, mentre i linfociti T CD8+/PD-1 high producono bassi livelli di TNF, pur mantenendo la capacità di rilasciare IFN. La correlazione dell’infiltrato linfocitario con le varianti geniche di PD-1 e PD-L1 ha evidenziato un ruolo degli SNV PD1.5C>T e PD-L1C>T rs2297136 nel reclutamento, nelle biopsie cutanee, di linfociti T CD8+ esprimenti vari livelli di PD-1. In particolare, i genotipi portatori della variante allelica T+ modificano sia la percentuale di linfociti T CD8+ PD-1 high che l’intensità di espressione di PD-1 high (aumentate per il primo SNV e diminuite per il secondo rispettivamente), rispetto ai genotipi wild type.
Targeted therapies (TT) and immune checkpoint inhibitors immunotherapy (ICB) has dramatically changed the treatment of metastatic melanoma (MM). Although targeted therapy achieved a response rate as high as 70%, most patients ultimately develop resistance and progressive disease. Immune checkpoint inhibitors, especially with anti-PD-1 monoclonal antibodies, achieve durable responses, but in less than 40% of patients. The majority of patients receiving these treatments ultimately face progressive disease due to the development of primary of secondary resistance. Since only a fraction of patients achieve a durable benefit, the identification of predictive biomarkers is an unmet need. The objectives of our present study are: i) Identification of new molecular targets through the extensive in vitro and in vivo characterization of tumor biopsies; ii) Investigation of associations between PD-1/PD-L1/PD-L2/CTLA-4 variants and tumor microenvironment immunoscore with overall survival of patients receiving TT and ICB; iii) Analysis of the immune effects of TT and ICB on NK cells and their interaction with melanoma cells. Forty-eight patients with advanced melanoma were enrolled and 33 tumor biopsies from 29 patients were analyzed. Patients received TT and/or anti-PD-1 drugs. We observed that TIM3 expression is associated with PD-1 expression, as it is exclusively expressed in CD8+/PD-1 high T cells, while both GmzB and Eomes are also expressed by CD8+/PD-1 low cells. Moreover, CD8+/PD-1 high T cells show a higher Ki67 expression, suggesting that these cells may proliferate within the tumor. CD8+/PD-1 neg/low T cells are able to produce both IFN and TNF after polyclonal stimulation, while CD8+/PD-1 high cells produce low levels of TNF, maintaining the ability to release IFN. The association between PD-1/PD-L1 variants with immune infiltrate highlighted the role of PD1.5C>T and PD-L1C>T rs2297136 SNV in CD8+ cells recruiting. In particular, genotypes harboring the allelic variant T+ modify both the rate of CD8+ PD-1 high cells and the intensity of PD-1 high expression, compared with wild type genotypes.
Melanoma, immunotherapy, anti-PD-1, PD-1
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