ISTOMORFOLOGIA DELLA PATOLOGIA ABORTIVA E RICERCA DI SPECIFICHE CORRELAZIONI CON ANOMALIE CROMOSOMICHE INDIVIDUATE MEDIANTE FISH

Background and Objectives Spontaneous abortion, defined as loss of a pregnancy without outside intervention before 20 weeks gestation, has an incidence estimated between 28% and 33% of clinically recognized pregnancies. Many risk factors have been documented and approximately the 50% of spontaneous abortion is due to chromosomal anomalies, in particular numerical alterations, known as “aneuploidies”. The aim of this study was to assess the presence of numerical chromosomal abnormalities in formalin-fixed paraffin embedded (FFPE) abortive material by fluorescent in situ hybridization (FISH) and establish a possible correlation with spontaneous abortion events. Furthermore, another goal was to ascertain a correlation of chromosomal aneuploidies with histomorphology in order to identify those morphological features possibly predicting chromosomal abnormalities. Materials and Methods A retrospective observational study was performed on 471 samples collected from women who experienced a first trimester spontaneous abortion referring to the period between January 2017 and April 2021, at the Pathology Laboratory of Giannina Gaslini Institute. The mean age of patients was 36 years. Abortive specimens were routinely processed for histopathological diagnosis by hematoxylin/eosin staining and by a panel of immunohistochemistry markers: smooth muscle actin, CD31, CD45, CD146, ck 18, Ki67, p63, p57 and plap. Then, FISH analysis was performed thanks to a set of probes identifying both sex and autosomal chromosomes (9, 13, 15, 16, 18, 21 and 22) mainly involved in pathology of abortion. Results Histopathological examination of abortive material confirmed the spontaneous abortion diagnosis for all the 471 samples. In 194/471 (41.2%), we observed morphological alterations suggestive of chromosomal anomalies, including irregular chorionic villi branching, throphoblastic invagination and inclusion, stroma with edema and reduced vascularisation. For 260/471 (55.2%) abortive specimens, the cause of miscarriage was attributable to other factors, for example co-occurring pathological maternal conditions. For the remaining 17 abortive specimens the histomorphology could not explain the cause of abortion. FISH analysis was successfully performed on 363/471 (77.1%) samples and a total of 166 chromosomal aneuploidies were identified. Different chromosome alterations were found in 108/166 (65.1%) spontaneous abortion specimens and most of them were trisomy (mainly involving chromosome 16) and monosomy. Two cases showed a double trisomy. Poliploidy was observed in 58/166 (34.9%) samples. Comparison between histomorphology and FISH was possible in 358 samples: no histomorphology/FISH anomalies were found in 117 cases; on the contrary, for 85 samples was possible to appreciate both structural alterations of the villi and the presence of chromosomal abnormalities. Correlation between histomorphology of abortive material and analysis by FISH was statistically significant (p<0,05). However, we observed 156 discrepant samples: morphological alterations of chorionic villi were not confirmed by FISH in 80 cases, while a chromosomal aneuploidy was observed in 76 structurally normal samples. Conclusion In this study, histomorphology of abortive material in FFPE and FISH for detection of specific chromosomal aneuploidies, represented useful tools to establish the possible causes of miscarriage. The analysis of discordant cases further revealed that the combined use of both approaches was able to better clarify the mechanisms of abortion. Since few data are already existing in literature, the overall results provide a contribute to improve the knowledge about abortion diagnosis, really supportive to clinicians and patients management.

Introduzione L’aborto spontaneo è l’evento clinico che determina l’interruzione di una gravidanza, senza intervento esterno, prima delle 20 settimane di gestazione. La sua incidenza è stimata tra il 28 e il 33% di tutte le gravidanze riconosciute, con una maggiore distribuzione del tasso di aborto in relazione all’aumento dell’età delle donne. I fattori di rischio sono molteplici e comprendo fattori anamnestici ed ambientali, patologie legate alla madre ed alterazioni genetiche dell’embrione. In particolare, le alterazioni cromosomiche dell’embrione sono causa di interruzione spontanea di gravidanza nel 50% dei casi e tra queste la percentuale maggiore è rappresentata dalle anomalie numeriche in cui si verificano variazioni del numero di cromosomi. Lo scopo di questa tesi è stato quello di identificare alcune delle principali anomalie cromosomiche numeriche, quale causa di aborto precoce, mediante l’indagine molecolare FISH (Fluorescent in situ hybridization) su campioni di tessuto fissati in formalina e inclusi in paraffina (FFPE). Questo lavoro si pone poi l’obiettivo di stabilire la presenza di correlazioni tra anomalie cromosomiche e aspetti isto-patologici osservati nei campioni al fine di definire determinate caratteristiche isto-morfologiche predittive della presenza di alterazioni cromosomiche. È stato inoltre importante il confronto dei risultati derivati dal nostro campione di studio con quanto riportato in letteratura. Materiali e metodi È stato effettuato uno studio osservazionale retrospettivo su campioni di materiale abortivo da interruzione spontanea di gravidanza del primo trimestre pervenuti da gennaio 2017 ad aprile 2021 alla UOSD Centro diagnostica ginecopatologica e patologia feto-perinatale dell’Istituto Giannina Gaslini di Genova sia da pazienti dell’Istituto stesso, sia da sedi regionali per la centralizzazione della malattia trofoblastica gestazionale. I campioni, costituiti principalmente da residui deciduali e coriali, sono stati inizialmente allestiti per l'esame isto-morfologico e successivamente selezionati e preparati per l'analisi mediante FISH. Il tessuto selezionato per eseguire la FISH deve contenere una porzione rappresentativa delle strutture coriali di origine embrionale. Per l’analisi del tessuto sono state eseguite, oltre alla colorazione di routine con ematossilina ed eosina, reazioni immunoistochimiche con marker per actina muscolare liscia, CD31, CD45, CD146, ck18, Ki67, p63, p57 e plap. Per l'analisi FISH è stato scelto un pannello per lo studio dei cromosomi sessuali e dei cromosomi autosomici 9, 13, 15, 16, 18, 21 e 22, principalmente coinvolti nell’eziologia della patologia abortiva. Risultati Da gennaio 2017 ad aprile 2021 sono stati studiati 471 casi di aborti spontanei del primo trimestre di cui 125 con sospetto di malattia trofoblastica. L'età media delle pazienti è di 36 anni. Mediante lo studio isto-morfologico dei tessuti corio-deciduali è stata confermata la diagnosi di aborto spontaneo del primo trimestre. In 194 campioni sono state osservate alterazioni morfologiche indicative della presenza di anomalie cromosomiche quali irregolarità della ramificazione dei villi e del rivestimento trofoblastico, forme villari bizzarre, presenza di inclusioni e/o invaginazioni del rivestimento trofoblastico, fenomeni degenerativi dello stroma (idrope e degenerazione cerea) e ridotta vascolarizzazione. In 260 campioni la causa di aborto spontaneo è stata attribuita ad altri fattori eziologici (flogosi, stati disglicemici materni, stati disendocrini, dismetabolici, stati disreattivi/autoimmuni) mentre 17 casi sono risultati non valutabili. L'analisi mediante FISH è stata eseguita su 447 campioni selezionati: in 24 casi non è stata richiesta per via dell'esiguità del tessuto coriale presente nel campione. A causa della scarsa visualizzazione dei segnali di fluorescenza non sono risultati valutabili 84 casi. Sono state individuate 166 anomalie cromosomiche (45,7%), causa di aborto spontaneo. In 108 campioni sono state osservate variazioni del numero di singoli cromosomi: trisomie e monosomie. In particolare, è stata osservata con maggiore frequenza la trisomia del cromosoma 16. Eventi di poliploidia sono stati evidenziati in 58 campioni, con la triploidia osservata con maggior frequenza. Due casi hanno mostrato la presenza di una doppia trisomia. In 117 casi l’assenza di particolari alterazioni morfologiche della componente coriale ha trovato corrispondenza con l’assenza di anomalie dei cromosomi indagati mediante la FISH. Allo stesso modo è stata osservata corrispondenza tra la presenza di alterazioni isto-architetturali dei villi e presenza di anomalie cromosomiche accertate dalla FISH in 85 campioni. In 80 casi la presenza di alterazioni a livello morfologico non è stata confermata dalla FISH mentre in 76 campioni risultati normali istologicamente è stata osservata la presenza di un’anomalia cromosomica. Nonostante queste discrepanze, l’associazione tra l’esame istologico di campioni di materiale abortivo e l’indagine mediante FISH è risultata statisticamente significativa (p<0,05). Conclusioni La patologia abortiva ha una elevata incidenza e un forte coinvolgimento psicologico per cui la diagnosi corretta ed esaustiva è di grande importanza. L'esame isto-morfologico dei campioni di materiale abortivo fissati in formalina e inclusi in paraffina è stato affiancato in questo studio all'esame mediante FISH per l'individuazione della presenza di determinate anomalie numeriche cromosomiche causa di aborto. La percentuale di anomalie cromosomiche osservate (45,7%) e il riscontro di una maggior frequenza della trisomia 16 tra le alterazioni del numero dei singoli cromosomi è in linea con quanto riportato dai dati in letteratura. Un dato importante che emerge da questo lavoro è l’associazione significativa tra le due metodiche utilizzate per la diagnosi, nonostante in diversi casi siano state osservate delle discordanze. La mancata conferma della presenza di anomalie mediante FISH nei casi in cui sono state osservate alterazioni isto-architetturali dei villi a livello istologico, può essere dovuta al limitato pannello utilizzato per lo studio dei cromosomi. Di più difficile interpretazione risulta la discordanza tra l’assenza di specifiche alterazioni a livello morfologico nei casi in cui la FISH mostra invece un’anomalia cromosomica numerica. In questi casi è possibile ipotizzare che l’alterazione non sia così grave da determinare una modificazione dell’architettura del tessuto. I risultati ottenuti da questa analisi mostrano che è opportuno affiancare all’esame istologico del tessuto abortivo l’analisi mediante FISH per fornire una diagnosi più completa che sia di supporto ai clinici e alle pazienti che vogliono pianificare future gravidanze. Ci spingono inoltre ad implementare la ricerca per ampliare ulteriormente la casistica e arricchire i pochi dati ad oggi presenti in letteratura riguardo la patologia abortiva spontanea. Un ulteriore spunto, avvalorato dall’esiguità dei dati in merito, consiste nell’approfondimento della ricerca sulle doppie trisomie che nella nostra casistica sono state evidenziate in 2 campioni.